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Institut für Klinische Neurobiologie

Arbeitsgruppe Prof. Dr. Carmen Villmann

Molekulare Pathomechanismen von Ionenkanalerkrankungen und motorische Bewegungsstörungen

 

Publikationen AG Villmann

 

AG Villmann
von li Rama Hussein, Georg Langlhofer, Sinem Milanos, Carmen Villmann, Niels von Wardenburg, Natascha Schäfer, Dieter Janzen

 

Forschungsziele

Fehlfunktionen von Glycinrezeptoren (GlyR) gehen mit motorischen Bewegungsstörungen einher. Glycinrezeptoren sowie auch Gamma-Aminobuttersäure (GABA) Rezeptoren sind an der synaptischen Inhibition im zentralen Nervensystem beteiligt. GlyRs sind hauptsächlich im Rückenmark und Hirnstamm beim Menschen und im Nager exprimiert, wo ihre Hauptfunktion in der Feedback Inhibierung und damit der Kontrolle der Erregungsleitung an den spinalen Nerven-Muskel Synapsen besteht. Im Hirnstamm hingegen spielt die glycinerge Inhibition eine wesentliche Rolle in der Generierung und dem Aufrechterhalten des Atemrhythmus.

Der Fokus unserer Arbeitsgruppe liegt auf den molekularen Pathomechanismen bei motorischen Bewegungsstörungen, welche auf Störungen in der glycinergen Neurotransmission beruhen. Mutationen im humanen GLRA1 Gen, welches für die Glycinrezeptor Alpha1 Untereinheit des adulten inhibitorischen GlyR-Komplexes kodiert, führen zur neurologischen Erbkrankheit Hyperekplexie (Startle Disease, Stiff-Baby Syndrom, OMIM #149400). Ausgelöst durch taktile oder akustische Reize ist Hyperekplexie durch die typische Startle Reaktion gekennzeichnet, die zu einem kompletten Verlust der Haltungskontrolle und Muskelsteifheit im frühen Kindesalter führt. Neben der humanen Hyperekplexie sind auch verschiedene Mausmodelle mit ähnlichen phänotypischen Symptomen beschrieben, die ebenfalls auf eine Mutation in einer Untereinheit des Glycinrezeptors (Glra1 oder Glrb Gen) beruhen (spastic, spasmodic und oscillator). Diese Mauslinien eignen sich als hervorragende Modelle, um GlyR-Kanalerkrankungen und die mit ihnen assoziierten motorischen Bewegungsstörungen zu untersuchen und besser zu verstehen.
Unser Ziel ist es, diese molekularen Pathomechanismen bei Hyperekplexie aufzuklären und damit einhergehend die physiologische Rolle der verschiedenen Glycinrezeptoruntereinheiten sowie deren interagierenden Proteinen in der synaptischen Inhibition im Hirnstamm und Rückenmark zu verstehen. Dafür werden verschiedene Ansätze verfolgt, die sich von Mutagenese bis hin zu transgenen Mausmodellen erstrecken und somit eine umfangreiche proteinbiochemische, immunzytochemische, immunhistochemische und elektrophysiologische Charakterisierung der beteiligten inhibitorischen Glycinrezeptorkomplexe erlauben.

Synapse
Inhibitorische Synapse. GlyRs sind postsynaptisch lokalisiert. Die neonatale Isoform des Rezeptorkomplexes besteht aus 2 Untereinheiten (homomere GlyRN). Die adulte Isoform GlyRA hingegen stellt heteromere Komplexe aus zwei alpha und drei beta Untereinheiten (alpha1beta or alpha3beta) dar. Das präsynaptische Glycin wird in Vesikeln durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) verpackt. Die Terminierung der glycinergen Neurotransmission wird durch Na+- und Cl- abhängige Transporter GlyT1 and GlyT2 vermittelt, die für die Wiederaufnahme/Recycling von Glycin verantwortlich sind. An der postsynaptischen Membran sind GlyRs durch Gephyrin verankert, welches spezifisch an die beta Untereinheit bindet. Gephyrin Domänen verbinden so die Rezeptorkomplexe mit dem Zytoskelett des postsynaptischen Neurons. Eine weitere wichtige Rolle spielt Gephyrin beim anterograden und retrograden Transport von GlyR Komplexen (GlyR/gephyrin/KIF5 oder GlyR/gephyrin/dynein). Oben rechts: GlyRs bilden heteromere, pentamere Cl- Kanäle. Unten rechts: Blick auf die Topologie einer GlyR Untereinheit, die aus einem langen extrazellulären N-Terminus gefolgt von vier Transmembrandomänen, die durch Schleifen miteinander verbunden sind, besteht.


Bisherige Ergebnisse


Während dominante Formen humaner Hyperekplexie sehr intensiv untersucht wurden, wurde den rezessiven Mutationen wenig Augenmerk geschenkt. Kürzlich konnten wir zeigen, dass rezessive Mutationen eine veränderte Oberflächenintegration und Stabilität der GlyRalpha1 Polypeptide bedingen. Wir konnten zeigen, dass instabile und möglicherweise fehlgefaltete GlyRalpha1-Proteine im endoplasmatischen Retikulum akkumulieren und von dort dem proteasomalen Abbauweg zugeführt werden. Die schwerwiegenden Symptome bei einem Patienten mit gekoppelter Heterozygotie sind aufgrund unserer Ergebnisse auf einen kompletten Verlust der Zelloberflächenexpression und damit das Fehlen inhibitorischer glycinerger Neurotransmission zurückzuführen. Ein kompensatorischer Mechanismus bei sonstigen Formen rezessiver Hyperekplexie ist durch das gesunde Wildtyp-Allel jedoch unabhängig vom GlyRbeta-Allel möglich. Die Charakterisierung neu identifizierter humaner Mutationen, die aus einem Screening von Blutproben der Patienten ermittelt werden, ist ein fortlaufendes Projekt im Labor.

Primärneurone
Linkes Bild: Primärneurone isoliert aus dem Rückenmark von Mäusen, weißer Balken entspricht 5µm. Weiße Pfeile markieren kolokalisierte GlyRalpha1 Rezeptoren (rot) und VIAAT (grün). Rechts: Film Z-Stapelung (n=10, 1µm jeweils) durch Rückenmarksschnitt; GlyRalpha1 (rot) und VIAAT (grün).

Neben den humanen Mutationen haben wir den Pathomechanismus der Mausmutante oscillator eingehend untersucht. Die Mausmutante besitzt verkürzte nicht-funktionelle GlyR alpha1 Varianten, die  drei Wochen Geburt die Letalität der Mausmutante bedingen. Den verkürzten alpha1 Varianten fehlt der C-terminale Teil des Rezeptors bestehend aus dem größten Teil der Schleife zwischen TM3 und 4 (Loop 3-4), der TM4 sowie dem eigentlichen C-Terminus. Die Ursache dieser Trunkierung ist eine Mikrodeletion, die eine Leserasterverschiebung zur Folge hat und ein vorzeitiges STOP Kodon einführt. Wir konnten zeigen, dass die Funktionalität der für sich selbst nicht-funktionellen alpha1 Konstrukte in vitro durch die Koexpression mit einer unabhängigen C-terminalen Domäne regeneriert werden kann. Unsere in vitro Ergebnisse sowie die Daten in Primärneuronen erkrankter oscillator Tiere zeigten erstmals, dass für sich selbst nicht-funktionelle Domänen in der Lage sind, sich zum funktionellen Ionenkanal zu komplementieren. Diese Daten sprechen für eine Domänenarchitektur aus unabhängigen sich selbst faltenden Domänen bei GlyRs und damit aufgrund der gleichen Topologie für die gesamte Superfamilie der Cys-Loop Rezeptoren. Domänenkoexpression könnte ein Mechanismus sein, der die intrazelluläre Akkumulation einzelner  nicht-funktioneller Domänen umgeht und gleichzeitig den ’Vorwärts’-Transport sich komplementierender Domänen vom ER zum Golgi und letztlich zur Plasmamembran favorisiert und dadurch funktionelle glycinerge Ionenkanäle regeneriert.

Ausblick


Die Überführung derartiger Experimente in die in vivo Situation, um den neurologischen Phänotyp aufzuheben, ist Gegenstand derzeitiger Forschung. Die Komplementierungsstudie an GlyRs als Modell öffnet neue Möglichkeiten für gentherapeutische Ansätze auch für andere genetisch assoziierte neurologische Ionenkanalerkrankungen, die auf verkürzte Proteine zurückzuführen sind wie z.B. bei mutierten GABAA Rezeptor Untereinheiten, die mit idiopathischer generalisierter Epilepsie (IGEs) assoziiert sind. Hier ist unser Ziel, die Rolle von Proteinmosaiken für die Regeneration synaptischer Plastizität bei hypertonen neurologischen Erkrankungen zu hinterfragen.
Des Weiteren wollen wir die physiologische Bedeutung der Loop 3-4 des inhibitorischen GlyRs verstehen. Dieser Loop repräsentiert den größten Teil der intrazellulären Domäne (ICD) dieser Rezeptorklasse. Kürzlich fanden wir weitere Hinweise auf die Multifunktionalität des basischen Motivs, das auch für den nukleären Import von GlyRs sowie für die Oberflächenexpression und korrekte Biogenese wichtig ist. Neue Interaktionspartner der Schleife 3-4 sowie eine mögliche physiologische Relevanz nukleärer GlyRs gilt es in gegenwärtigen Forschungsprojekten herauszufinden.